摘要：將某雞場送檢的病死雞作為研究對象，分析其細菌性疾病的主要病原菌，通過分離培養、生化實驗、免疫熒光抗體染色、藥敏試驗以及PCR試驗等步驟，分析病原菌的形態特征，了解其耐藥性，并將其PCR測序結果與GenBank數據庫中的基因序列進行對比，對比結果表明病原菌為綠膿桿菌。

    綠膿桿菌又被稱作銅綠假單細胞菌，能夠導致多種動物的臟器出現膿腫，所以綠膿桿菌可以從傷口的膿液中分離獲得。各年齡段的雞都會受到綠膿桿菌的感染，導致肺炎、心肌炎以及肝周炎等疾病，死亡率高達80%。

    1  實驗材料

    實驗樣品選取某雞場送檢的4只病死雞，對其進行剖檢，并在無菌環境下采集病死雞的肝臟與肺臟；實驗采用的試劑包括瓊脂糖、DL2000DNAMarker、10×LoadingBuffer、腸桿菌科、JAMES液以及快速革蘭氏染色液等；實驗采用的培養基包括血瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基等。

    2  實驗方法

   （1）細菌的分離培養。在病死雞的肝臟和肺臟中分離出細菌，通過劃線方法將其接種于麥康凱平板、營養瓊脂平板以及血液瓊脂平板上，分別將3個平板放置于37℃的條件下培養24小時。然后選取其中的典型菌落，分別設置為1-4號，在典型菌落純培養的過程中進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細菌。

   （2）細菌的生化實驗。根據腸桿菌科相關鑒定試劑盒中帶有的說明書，對細菌分離培養中的純培養物進行生化實驗。實驗的儀器為ATB自動生化檢定儀，明確雞源細菌的種屬。

   （3）免疫熒光抗體染色。在載玻片中滴加1滴PBS，并在培養基中挑取單個菌落均勻涂布在載玻片的PBS上，在菌落自然干燥后使用甲醇進行15分鐘干燥；再使用PBS沖洗5分鐘，共沖洗3次；然后在載玻片上添加一抗，在37℃的條件下孵育30分鐘，再使用PBS沖洗之后添加二抗，在37℃的條件下孵育30分鐘；最后使用PBS沖洗后使用蒸餾水漂洗，干燥后放置于熒光顯微鏡下觀察。能夠產生藍綠色熒光素以及藍色綠膿素的細菌為綠膿桿菌。

   （4）藥敏試驗。制作綠膿桿菌的肉湯培養物，根據Kirby-Barer氏法，在營養瓊脂平板的表面均勻涂布培養物。使用無菌鑷子將20種抗生素的藥敏試紙粘貼于培養基表面（需要注意的是，藥敏試紙需要等距粘貼），然后將培養基放置于37℃的恒溫培養箱中培養18~24小時。培養期間觀察并記錄試紙上的抑菌圈直徑，按照NCCLS（2009）標準進行藥敏試驗結果分析。

   （5）PCR試驗。應用細菌純培養物進行PCR試驗，首先將其接種于普通LB液體培養基中，進行24小時培養，然后根據樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒中帶有的說明書，進行分離菌株基因組DNA的提取，進一步鑒定綠膿桿菌。試驗采用的上游引物序列為5’-CCGTGCTTCAGT-TCCAGTGTG-3’，下游引物序列為5’-GTGGCGGACG-GGTGAGTAA-3’。最后根據基因組DNA進行PCR反應，并通過1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，明確PCR產物的序列。

    3  實驗結果

   （1）細菌分離培養結果。分離培養后，營養瓊脂平板上的菌落呈現出表面光滑、邊緣參差的形態，整體呈綠色，具有一定的芳香氣味；麥康凱平板上的菌落呈半透明形態，整體為圓形；血液瓊脂平板上的菌落為不規則形狀，呈灰色，帶有溶血環。通過顯微鏡觀察，1~4號分離菌均為革蘭氏陰性小桿菌，初步判定細菌為綠膿桿菌。

   （2）生化實驗結果。1~4號分離菌的生化實驗結果相同，都可以分解酯酶、尿素酶以及D-葡萄糖，可以將其鑒定為綠膿桿菌，符合率高達99.9%。

   （3）抗體染色結果。1~4號分離菌染色后在顯微鏡下呈現的形態為兩端鈍圓，顏色為熒光綠色，屬于短小桿菌，與綠膿桿菌的特征相符。

   （4）藥敏試驗結果。1~4號分離菌的藥敏試驗結果相差無幾，對大觀霉素、慶大霉素以及頭孢曲松等藥品高度敏感，對強力霉素以及四環素中度敏感，對紅霉素以及頭孢噻吩等藥品不敏感，具有一定的耐藥性。

   （5）PCR試驗結果。根據PCR試驗獲得的序列，將其與GenBank中公布的16株參考菌株進行同源性比對，比對結果顯示，2號分離菌的同源性在99.7%~100%之間，可以將其鑒定為綠膿桿菌。

    4  結論

    綜上所述，綠膿桿菌對于阿莫西林、頭孢噻吩以及紅霉素有較強的耐藥性，對頭孢曲松、阿米卡星以及慶大霉素等高度敏感，可以使用這類藥品進行防治。

   （張楊子 貴州省畜牧獸醫研究所）