王興群 毛以智 張文磊
遵義職業技術學院動科系
遵義市動物疫病預防控制中心

    近年來，豬病混合感染或繼發感染日趨嚴重，由于其具有多因性、復雜性等特點，給豬病的正確快速診斷以及采取科學有效的防治措施帶來了困難。豬偽狂犬病、豬圓環病毒病、大腸桿菌病是嚴重危害養豬業的疫病，是高度接觸性傳染病，仔豬十分易感，一年四季均可發生，主要危害出生后幾小時至斷奶后2周內的小豬，尤以初生仔豬多發，呈地方性流行，一般表現為突然發生，病勢急，造成仔豬出現嚴重敗血癥、腹瀉和衰竭而死亡，發病率和死亡率均較高，給地方養豬業帶來巨大經濟損失。2012年底～2013年年初，遵義多家養豬場相繼發生不明原因仔豬疫病，主要表現為仔豬體質弱、消瘦、腹瀉，呼吸困難甚至突然死亡，為查明病因，對發病豬進行了實驗室診斷，為本次疫情防控明確了方向。

1　試驗材料與方法
1. 1　病料
實驗室檢測的患豬的病料隨機采集自貴州省遵義市某養豬場。
1. 2　試劑
    胰蛋白胨、酵母粉購自Oxiod 公司；藥敏紙片均為購買臨床用藥后于實驗室自制；新生小牛血清購自貴陽恒因生物有限公司。豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR 檢測試劑盒（含RNA提取試劑盒）、豬瘟病毒RT-PCR 檢測試劑盒、豬偽狂犬病毒PCR檢測試劑盒、豬圓環病毒2型PCR檢測試劑盒均購自世紀元亨公司。
1. 3　流行病學調查
向畜主調查發病情況、臨床癥狀，剖檢病豬情況，記錄結果。
1. 4　細菌檢測
    無菌采取病料肝臟、脾臟、心臟劃線接種在鮮血瓊脂平板培養基上，于無氧和有氧兩種條件下，37 ℃恒溫培養24 h，并對純化細菌繼續生物實驗鑒定和藥物敏感實驗。
1. 5　C SFV 和PR R SV 的R T-PC R 檢測
    分別取病死仔豬病變肺組織、淋巴結、腎臟加適量D EPC水進行充分研磨，反復凍融3次后，按試劑盒說明書提取病料組織總RNA及RT-PCR擴增，20 μl  RT-PCR體系如下：16. 8 μl  RT-PCR反應液，1. 2 μl 酶混合液，2. 0 μl 模板。反應條件：42 ℃、45 m i n；94 ℃、3 m i m ；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環；72 ℃延長7 m i n。擴增產物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.6　豬繁殖與呼吸綜合癥（P R V ）和豬圓環病毒病Ⅱ型
PC V 2 的PC R 檢測分別取病死仔豬病腦組織、淋巴結等研磨，反復凍融3次后按試劑盒說明書提取病料組織總DNA及PCR擴增，20 μl  RT-PCR體系如下：16. 0 μl RT-PCR反應液，1. 2 μl酶混合液，2 μl模板。反應條件為：42 ℃、45 m i n；94 ℃、3 m i m ；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個循環；72 ℃延長7 m i n。擴增產物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2　結果與分析
2. 1　流行病學調查結果
該養殖場飼養母豬600頭，公豬15頭，哺乳仔豬1 200頭，保育豬1 100頭，育肥豬1 600～1 700頭，各豬群均發生腹瀉，其中，以2～3 日齡哺乳仔豬腹瀉嚴重。剖檢斷奶前仔豬與保育豬可見淋巴結發紫出血，腎臟有明顯出血點。
2. 2　細菌學檢測結果
2.2.1　細菌分離與鑒定
無菌取送檢病豬材料進行細菌分離培養，37 ℃培養過夜后，培養基表面長出灰白色、圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊、微凸起菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌。
2.2.2　藥物敏感試驗
取上述純化細菌均勻涂于肉湯培養基上，選擇常見獸用抗生素進行藥物敏感試驗，結果詳見附表。從藥敏試驗結果可知，分離細菌對多種藥物不敏感。建議：首選腸道康（乙酰甲喹）對病豬群進行治療，對臨床健康豬群進行預防性治療，以控制病情擴散。
2. 3　豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病原核酸檢測
采集病豬材料經試劑盒提取病料總R N A ，分別以豬瘟病毒（CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）RT-PCR檢測試劑盒對上述核酸樣本進行目的基因擴增。
2. 4　豬偽狂犬病，豬圓環病病原核酸檢測
采集病豬材料經試劑盒提取病料總DNA，分別以豬偽狂犬病毒（PRV）和豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）PCR檢測試劑盒對上述核酸樣本進行目的基因擴增。

3　討論
    當前引起仔豬發病死亡的原因很多，混合感染導致病情較復雜，診斷困難，防治效果不理想。由于同時存在幾種病原混合感染，這些混合感染既有細菌與細菌、病毒與病毒、細菌與病毒，還有傳染病和寄生蟲病或普通病等。混合感染通過簡單的流行病學調查、臨床剖檢等方法卻很難分辨，必須通過實驗室檢測才能確診，主要通過PCR[ 1，2]、RT-PCR[ 3]、RT-LAM P[ 4]、ELISA[ 5]等方法進行實驗室診斷，必要時可做動物回歸試驗[6]。發生疫情時及時進行實驗室診斷并采取對應的方案，可極大地減少損失。本病例經流行病學調查，實驗室細菌學和分子生物學檢測，確診本次疫情應為豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒Ⅱ型與大腸桿菌混合感染所致。
混合感染病例在我市很多豬場時有發生，并且有越來越多的趨勢，應引起我們高度重視。混合感染病例必須進行系統的診斷，及時找出是由哪些病原共同感染引起。對于由多種病原混合感染引起的疫病，必須采取綜合防治措施，強化免疫接種并加強飼養管理以及藥物防治等，才能有效控制疫病的流行，減少死亡。
豬圓環病毒病是嚴重的免疫抑制性疾病，豬在感染豬圓環病毒Ⅱ型后，病毒在機體內的各種淋巴細胞中繁殖、復制，從而使豬體內的T淋巴細胞和B 淋巴細胞數量減少，導致患豬體況下降，形成免疫抑制，從而導致機體的免疫力大大下降。細菌感染后，由于不能科學的用藥導致耐藥菌株的不斷增多、耐藥譜日益擴大。這些疾病的發生都是相輔相成的，這也提醒我們需要進行綜合防控。以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征為主的重大疫病危害巨大且廣泛存在，要高度重視其綜合防控，尤其要搞好平時的免疫。