摘要：近幾年來，實驗室安全已經越來越被國家重視，實驗室消毒方法也層出不窮。筆者所在的實驗室規定了獸醫實驗室消毒的基本方法以及實驗室環境消毒、實驗室器材消毒、實驗室物品消毒、實驗室工作人員和污染物等消毒方法與消毒效果評價標準，這為規范實驗室消毒工作提供了相關依據，為獸醫實驗室工作人員的生物安全提供了技術保障。

    1 實驗室的消毒方法

    1.1 物理消毒法

    是指利用物理因素殺滅或消除病原微生物及其他有害微生物的方法。主要包括射線消毒法和熱力滅菌法。

    1.1.1 射線消毒法

    射線消毒法主要包括紫外線消毒和電離輻射消毒，可用于一次性醫用塑料制品的批量滅菌。應用較多的是紫外線消毒。紫外線穿透力較弱，普通玻璃、塵埃、紙張等均能阻檔紫外線，一般用于手術室、病房、實驗室的空氣消毒及物理表面消毒。紫外線空氣消毒效果與房間面積、紫外線燈功率大小、燈具數量、照射時間、空氣溫濕度及物理表面潔凈度有直接關系。一般紫外線燈波長200nm～300nm具有殺菌作用，以250nm～260nm最強，可導致微生物的變異或死亡。懸吊式紫外線燈平均功率為1.5W/m3，照射時間不低于30min。紫外線可損傷皮膚和角膜，應注意個人防護。電離輻射消毒法包括X射線、γ 射線和加速電子等，對各種微生物均有致死作用，多用于一次性醫療用品、生物制品等的消毒，但操作復雜，成本相對較高。

    1.1.2 熱力滅菌法

    熱力滅菌法主要包括干熱滅菌法與濕熱滅菌法。其原理是利用熱力、光照、輻射等物理作用，破壞微生物細胞，導致其死亡。干熱滅菌法包括干熱燃燒滅菌法和干烤滅菌法，可用于不耐濕的物品。焚燒法適用于能在焚燒爐內焚燒的物質，適用于某些特殊感染、尸體或廢棄的污染物等。濕熱滅菌法包括煮沸滅菌法、流通蒸汽滅菌和高壓蒸汽滅菌法，高壓蒸汽滅菌法傳熱快，穿透力強，可用于耐高溫、高壓、高濕的物品，可用于各類器械、醫用敷料、培養基等物品的滅菌。

    1.2 化學消毒法

    化學消毒藥物可作用于微生物和病原體，使其蛋白質變性，失去正常功能而死亡。常用的有氯消毒劑、碘類消毒劑、氧化消毒劑、醛類消毒劑、酚類消毒劑、醇類消毒劑、季胺類消毒劑等。其中，氯類、醛類消毒劑屬于高效消毒劑，具有腐蝕和漂白作用，可用于物體表面和皮膚消毒。臭氧可用于空氣消毒。醇類、碘類消毒劑屬于中效消毒劑，一般用于醫療護理器、皮膚和黏膜的消毒。季銨鹽、胍類消毒劑屬于低效消毒劑，可用于皮膚、黏膜、物品表面及地面等消毒。因其屬于陽離子表面活性劑，不得與陰離子表面活性劑合用。

    1.3 生物消毒法

    1.3.1 生物消毒劑

    生物消毒劑是指用植物提取物、生物酶等制備的具有體外殺菌作用的生物制品。主要包括天然植物提取物、煎煮物、生物酶類等的生物活性物質。其特點有：殺菌作用可靠，性能溫和，無刺激性；低毒，不污染環境；無易燃性，使用和儲存運輸安全，但殺菌譜有限。

    1.3.2 生物學消毒法

    生物學消毒法是利用生物氧化和生物熱原理來殺滅或消除病原微生物的方法。在自然界中，有的生物在新陳代謝過程中，可利用嗜熱細菌繁殖時產生的熱，形成不利于病原微生物存活的環境，從而抑制或者殺滅細菌繁殖體、病毒、寄生蟲蟲卵等微生物，主要用于污染的飼料、糞便、污水、垃圾及其他廢棄物等的消毒處理。糞便、污物等采用此法消毒后不失去作為肥料的使用價值，方法簡便，比較經濟，適于在生產中應用。

    2 實驗室消毒分類

    2.1 實驗室環境消毒

    2.1.1 自然通風

    可自然通風開窗換氣，條件允許時采用排風扇機械通風。

    2.1.2 紫外線消毒

    紫外線燈可直接照射，要求≥1.5W/m3，照射時間在30min～60min；紫外線燈離物體表面不宜超過1m，照射過程中人員不得出入。紫外線燈管表面要保持干凈，每1周～2周用紗布或棉球擦拭1次。

    2.1.3 臭氧噴霧消毒

    對于在空氣中飄浮的細菌，臭氧滅菌濃度為4mg/m3～8 mg/m3。對物體表面沉降菌落，臭氧滅菌濃度為20mg/m3～30mg/m3，相對濕度60%～80%，密閉門窗2h。

    2.1.4 無菌室消毒

    無菌室在使用前后可直接用紫外線照射30min～60min?；蛎荛]無菌室門窗，臭氧噴霧消毒，滅菌濃度為20mg/m3～30mg/m3，相對濕度60%～80%，密閉門窗2h。消毒過程中人員不得出入。

    2.2 器材消毒

    2.2.1 玻璃器皿的消毒

    消毒吸管時，先將吸管口塞入少許脫脂棉，松緊適宜，而后用牛皮紙包裹。試管或三角燒瓶用紗布棉塞將管口塞好，外面用紙張包好。燒杯可直接用紙張包扎。包裝好的物品用干熱消毒滅菌或壓力蒸汽滅菌即可。

    2.2.2 金屬器械的消毒

    用過的手術刀剪、鑷子、止血鉗等應先用超聲波清洗干凈，然后放入有洗滌劑的水中煮沸消毒15min，再用清水、蒸餾水將其沖凈，最后煮沸15min或干熱消毒備用。

    2.2.3 橡膠制品消毒

    污染的橡膠塞、吸頭等可用洗滌劑溶液煮沸15min～30min，然后清水洗滌瀝干后壓力蒸汽滅菌處理后備用。

    2.2.4 搪瓷器皿的消毒

    將方盤、托盤等搪瓷器皿浸泡在1%漂白粉澄清液中1h，然后用洗滌劑溶液刷洗，再用清水洗凈后備用。

    2.2.5 接種環、涂布棒的消毒

    接種環、涂布棒在使用前后要進行火焰燒灼消毒。

    2.3 物品消毒

    2.3.1 工作服消毒

    普通工作服用洗滌劑70℃以上溫度在專用洗衣機內洗30min，再用清水漂洗。可能接觸人畜共患病的工作服用含有效氯500mg/L的消毒劑浸泡30min，再用洗衣粉溶液洗滌30min～60min，最后用清水漂洗干凈。工作服污染有病原體時，須經121℃、20min壓力蒸汽滅菌處理后，再用洗衣粉溶液洗滌30min～60min，最后用清水漂洗干凈。

    2.3.2 培養基的消毒

    一般基礎培養基用121℃滅菌15min～20min；含糖培養基常采用115℃、10min～15min壓力蒸汽滅菌。雞蛋、血清培養基及其他不耐熱的培養基可采用流動蒸汽滅菌法，80℃～100℃滅菌30min，每日1次，連續3d。含有尿素、血清等不耐熱物質的培養基，還可用過濾除菌法進行滅菌。

    2.3.3 塑料用品的消毒

    重復使用的耐熱塑料用品可浸入洗滌劑溶液煮沸15min～30min，然后清水洗滌，瀝干后進行壓力蒸汽滅菌。不耐熱的塑料器材可在有效氯濃度為0.2%～0.5%的消毒劑中浸泡60min，然后用清水洗滌瀝干。一次性塑料耗材（包括PCR管、離心管、移液槍頭等）按照使用說明進行使用，使用后直接消毒處理。

    2.4 工作人員的消毒

    工作人員是傳播病原微生物的重要媒介，做好日常消毒在工作中是非常重要的，尤其是手的消毒更為重要。為了節省時間，實驗室最好選用免洗消毒液或配備裝有 75%乙醇速干消毒劑的洗手消毒器，以快速清除手部的細菌及病毒，避免疾病的傳播。個人防護裝備可采用一次性防護服，保證工作人員的安全。

    2.5 污染物的消毒

    2.5.1 實驗臺面或地面的消毒

    正在做實驗時，一旦微生物污染了實驗臺面或地面，應立即停止實驗操作，快速進行污染物的消毒處理。首先使用含氯吸濕材料覆蓋污染物，然后根據目標微生物選擇有效消毒劑作用30min，將吸濕材料與實驗樣品一起小心放入污物袋中焚燒處理。

    2.5.2 污染物敷料桶的消毒

    污染物敷料桶如每天使用，要每天消毒1次。將桶內污物倒去后，用0.2%過氧乙酸溶液噴霧消毒，放置30min。桶內倒出的污敷料按廢棄物處理。

    3 消毒效果檢測

    3.1 空氣消毒效果的評價

    3.1.1 采樣時間

    消毒前采樣及消毒后采樣。消毒前采樣的目的是為了了解消毒前空氣中微生物水平；消毒后采樣目的是為了了解消毒后空氣中微生物水平。消毒前采樣應關好門窗，在無人走動的情況下，靜止10min后采樣。消毒后采樣一般應選擇在消毒滅菌處理完成之后的時間段，按預定計劃進行常規檢測，定期、定時對空氣進行樣品采集。
    
    3.1.2 采樣空氣消毒效果評價指標

    評價指標有空氣中的自然菌、大腸桿菌、白色葡萄球菌、溶血性鏈球菌等。按照采樣器說明進行采樣，采樣結束后，采樣培養皿置于37℃溫箱內培養24h～48h，觀察結果并記錄培養皿上的菌落數。

    3.1.3 菌落數計算

    每立方米菌落數＝（培養皿菌落數×1000）/（流量×采樣時間）。

    3.1.4 效果評價

   （1）細菌總數根據不同空間空氣細菌總數的國家衛生標準來判定其消毒是否合格。

   （2）殺滅率＝（消毒前菌落數－消毒后菌落數）/消毒前菌落數×100％。該方法不適合潔凈室內空氣采集，結果誤差大；作為空氣消毒方法考核誤差也較大。由于使用簡便、經濟，主要用于基層。

    3.2 物體表面消毒效果的評價

    3.2.1 微生物學指標評價

    物體表面消毒效果的微生物學指標包括細菌總數及大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等。

    3.2.2 采樣時間

    在物體表面經過消毒之后進行采樣，并以消毒前同一物體表面同一部位附近作為對照樣品，計算其殺滅率。

    3.2.3 采樣及培養方法

    3.2.3.1 壓印法

    將營養瓊脂按說明煮沸滅菌后倒入無菌培養皿內，并使瓊脂培養基高于培養皿1mm～2mm，待瓊脂冷卻后，將培養皿上的瓊脂培養基直接壓在被檢物體表面10s～20s，然后蓋好培養皿，在37℃溫箱中培養24h～48h，觀察結果，計算菌落數。

    3.2.3.2 棉拭子法

    消毒前采樣。被檢物體采樣面積小于100cm2時，應取物體的全部表面；采樣面積大于100cm2時，應連續采集4個樣品，面積合計 100cm2。用5cm×5cm的標準無菌規格版，并放在被檢物體表面，將無菌棉拭子在含有無菌生理鹽水的試管中浸濕，并在管壁上擠干，對無菌規格板框定的物體表面進行涂抹采樣，來回均勻涂抹10次，并隨之轉動棉拭子。采樣完畢后，將棉拭子放入裝有生理鹽水的試管管口，剪去與手接觸的約1cm棉拭子，剩余的棉拭子留在試管內，充分振蕩混勻后待檢。

    消毒后采樣。在消毒結束后，與消毒前同一物體表面附近部位進行相應采樣。采樣與消毒前一致。將消毒前后樣本盡快送檢，進行活菌培養計數及相應致病菌與相關指標菌的分離和鑒定。

    3.2.4 檢驗方法

    細菌總數檢測采用菌落計數法，致病菌的檢測主要檢測大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等。

    3.2.5 評價指標

   （1）細菌總數。小型物體表面結果計算用菌落形成單位來表示。

    細菌總數＝平板上菌落平均數×稀釋倍數。采樣面積大于100cm2的物體表面結果用細菌總數表示。

    細菌總數＝平板上菌落×稀釋倍數 / 采樣面積（cm2）。

   （2）殺滅率＝（消毒前菌落平均數－消毒后菌落平均數）/ 消毒前菌落平均數×100％。

    3.3 皮膚黏膜和手消毒效果的評價

    3.3.1 微生物學指標

    皮膚黏膜和手消毒效果的微生物學指標包括細菌總數和一些致病菌（大腸桿菌、葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和沙門氏菌等）。

    3.3.2 采樣時間

    在消毒后立即采樣，也可在消毒前采樣作為細菌的殺滅率對照。

    3.3.3 采樣方法

    3.3.3.1 手的采樣

    被檢者五指并攏，操作者用浸有生理鹽水棉拭子脫液后在被檢者雙手指屈面從指根到指端往返涂擦2次（一只手涂擦面積約30cm2），并隨手轉動棉拭子采樣，將棉拭子放于10mL生理鹽水的試管管口，剪去操作者手接觸部位棉拭子，采樣部分留在試管內，立即送檢。

    3.3.3.2 皮膚黏膜采樣

    將直徑為5cm×5cm的標準滅菌規格板，放在被檢皮膚黏膜處，用浸有生理鹽水的棉拭子脫液后在規格板內橫豎往返涂擦5次，并隨之轉動棉拭子，將棉拭子投入裝有無菌生理鹽水的試管管口，剪去操作者與手接觸處，其余棉拭子留在試管內，立即送檢。

    3.3.4 評價指標

    將采樣管在混勻器上振蕩20s，用無菌吸管取1.0mL 的待檢樣品拌種于滅菌平皿內，邊傾注邊搖勻，倒置于37℃溫箱中培養48h。計算菌落數。

   （1）細菌總數（CFU/cm2）＝平皿上菌落數×稀釋倍數 / 采樣面積（cm2）。

   （2）殺滅率＝消毒前菌落數 - 消毒后菌落數/消毒前菌落×100％。

    3.4 浸泡消毒液效果的評價

    3.4.1 方法與步驟

   （1）用無菌吸管吸取1mL浸泡消毒液加入9mL稀釋液試管內。當消毒不同時，所用的稀釋液也不同。對醇、氯、醛類消毒劑，可用含有中和劑的營養肉湯；對碘類、酚類＋洗滌劑、氯制劑＋洗滌劑、季銨鹽類及低濃度雙胍類消毒劑，可用營養肉湯＋3%吐溫80。

   （2）將以上稀釋10倍的消毒劑混合液用50滴/mL無菌滴管吸取，接種于營養瓊脂平板上，共滴2塊平板，再用1塊滴加蒸餾水的平板做對照。此項工作應在采樣后1h內結束。

   （3）培養。將做好的營養瓊脂平板放在37℃溫箱內培養3d后可觀察結果。

    3.4.2 結果評價

    在加入消毒液的2塊平板上觀察，如果1塊或2塊平板上有細菌生長，說明消毒液內有活菌存在。若僅有1個～2個菌落，說明消毒效果可靠，因為消毒劑的作用是消毒而不要求達到滅菌。若大于5個菌落，說明消毒效果不好?？砂匆韵鹿接嬎忝亢辽疽簝却婊畹木鷶怠?br>
    1mL消毒液內存活菌數＝菌落生長數/平皿×10×5。

    式中，×10是因為采取的10倍稀釋消毒液；×5是由于采取10滴消毒液相當于1/5mL。

    4 結論

    隨著實驗室生物安全問題越來越被國家工作人員重視，做好實驗室消毒和滅菌工作是保護實驗室工作人員不被病原微生物和廢棄物感染的重要環節。在建立健全實驗室規章制度和認知、熟悉過程中，加強生物安全實驗室的個人防護、實驗室的正確管理及突發不可知生物實驗安全操作教育工作，定期進行實驗室生物安全培訓，強化消毒滅菌意識，選擇經過驗證的高效、安全的消毒技術方法與正確的消毒效果評價，是保障實驗環境、實驗室工作人員生物安全身心健康必不可少的內容。

    第一作者簡介：于鳳芝，1972年出生，女，高級實驗師，主要從事畜牧獸醫研究工作。

   （于鳳芝 關文怡 喬立東 雷莉輝 艾君濤  北京農業職業學院）