摘要：近年來，隨著我國畜牧業的快速發展，布魯氏菌病發病率有上升的趨勢。借鑒已消除該病國家的防控和凈化措施，疫苗的免疫預防是關鍵因素。除了傳統的細菌培養疫苗牛種S19株、羊種Rev.1株、豬種S2株以及牛種RB51株，利用基因工程技術針對布魯氏菌侵害機體的過程及其免疫抗原物質構建的新興疫苗得到不斷發展。筆者對布魯氏菌的特點、危害、致病機制及動物疫苗應用進展進行介紹。

    布魯氏菌病（簡稱布病）是一種嚴重的人獸共患傳染病，致病菌為布魯氏菌（Brucella），除了可以通過皮膚、黏膜感染，還可通過消化道和呼吸道感染。我國將其列為乙類傳染病，世界動物衛生組織將其列為B類法定傳染病。

    1 布魯氏菌的特點

    布病是一個流傳久遠的疾病。據考證，公元前750年，古埃及人的尸體顯示有其生前患有布病的癥狀（明顯的骨關節炎癥及損傷等）。1887年，英國軍醫David Bruce從死于熱性病的士兵脾臟中分離并發現布魯氏菌。此間，經過人類不斷研究，完善了對該菌的認識。布魯氏菌長0.6μm ～1.5μm、寬0.5μm～0.7μm，為革蘭氏陰性球桿菌或短桿菌，主要寄生部位是動物細胞內。無鞭毛和芽孢，一般無莢膜，具有革蘭陰性菌典型的3層膜結構，即肽聚糖層外有特殊的3層外膜結構，由內向外依次為脂蛋白、脂質雙層和脂多糖。根據外膜上的脂多糖（lipo-polysaccharides，LPS）是否含有O鏈結構，可以將布魯氏菌分為光滑型（smooth，S）和粗糙型（rough，R）。其中，R型是O鏈缺失型，在一定條件下，由于參與LPS合成基因的突變和缺失可使S型和R型之間相互轉換。根據對宿主的偏好，布魯氏菌屬分為6個經典種，分別為羊種、牛種、豬種、犬種、沙林鼠種和綿羊附睪種。隨著研究范圍的擴大，又相繼鑒定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鰭型）、B.ceti（鯨型）以及 B.inopinata（分離自人體）。我國流行的主要是羊、牛和豬種布魯氏菌，其中羊種最為多見，且病情較復雜、嚴重。

    2 致病機制及研究現狀

    布魯氏菌侵入機體后，到達的第一個免疫器官是淋巴結，在這里吞噬細胞會將其吞噬。如未將其殺滅，則會在胞內大量繁殖，使吞噬細胞破裂而解體，大量細菌進入淋巴液和血循環。此時機體免疫系統啟動，宿主出現發熱。當細菌再次到達淋巴結等器官，宿主體溫恢復。循環往復，臨床上稱為“波浪熱”。人感染布魯氏菌后常表現為發熱和關節疼痛等癥狀。如在急性期治療不徹底，轉為慢性，更有甚者會喪失勞動能力。動物感染后，母畜常出現流產、不孕，公畜出現睪丸炎，影響家畜生產繁殖能力以及畜產品的質量安全。

    鑒于布病對人類健康及畜牧業的嚴重威脅，防治工作刻不容緩。其中，疫苗的研發和應用是關鍵。隨著對布魯氏菌致病機制及機體免疫應答程序的深入研究，特別是近年來基因研究技術的發展和普及，極大促進了布病疫苗研制工作。自2002年羊種16M菌株的基因組序列公布后，其他布魯氏菌株的測序已經完成。各菌株間有很高的序列一致性，但存在不同程度缺失、插入、倒置和移位現象。除豬種3型686株含1條染色體外，其余布魯氏菌中都含2條環形染色體。染色體Ⅰ約2.11Mbp，GC含量為57.2%；染色體Ⅱ約1.18Mbp，GC含量為57.3%。

    脂多糖（LPS）和外膜蛋白（outer-membraneprotein，OMP）是機體免疫系統識別布魯氏菌的主要抗原。LPS的O鏈是布魯氏菌的活性部分，參與抑制宿主細胞的凋亡，從而逃避宿主免疫系統。當S型菌株突變為R型菌株意味著其毒力的下降。目前，血清學是常用的檢測布魯氏菌的方法，如虎紅平板凝集實驗（RBPT）、標準試管凝集實驗（SAT）和補體結合實驗（CFT）。這些方法都是基于LPS的O鏈的抗體檢測，由于R型布魯氏菌疫苗免疫時，機體不會產生針對O側鏈的抗體，故血清學方法可區分R型布魯氏菌疫苗的自然感染和疫苗免疫。巨噬細胞與胎盤滋養層細胞是布魯氏菌感染的主要靶細胞，它還能在樹突狀細胞中也可生存。區別于其他病原微生物，布魯氏菌不具備經典的毒力因子，且在兩種宿主中會產生不同的基因子集（sub-sets of genes），致使布魯氏菌的致病機制更為復雜多變。目前，已鑒定分離的毒力因子有脂多糖、外膜蛋白、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等應激反應蛋白。如此繁多的毒力因子，可降低細胞遞呈能力，抑制細胞凋亡。

    3 疫苗分類

    因減毒活疫苗可以刺激機體的細胞免疫系統，產生良好的免疫保護效果，故在實際生產中應用廣泛。經典的布魯氏菌動物疫苗有S19和Rev.1。我國常用的是S2、M5和S19，南美的部分國家和美國多使用RB51。

    3.1 傳統細菌培養的疫苗株

    根據疫苗株的獲得途徑不同，可將其劃分為3類：①通過細菌的傳代培養，直接篩選出弱毒活菌苗，如S19、Rev.1和M5等；②根據細菌特性利用生物化學手段將其滅活，后期加入佐劑制成的滅活苗，如45/20、H38等；③在傳代培養中篩選出的自然突變株，如RB51。根據疫苗株來源不同，又可分為光滑型疫苗和粗糙型疫苗。

    3.1.1 常見的光滑型疫苗

    S19（B.abortus strain 19）疫苗是在新澤西某牛場的牛奶中分離，經實驗室傳代培養1年以上自然減毒獲得。因該菌株毒力較強，有感染人和使母畜流產的風險，最終被美國農業部禁用。20世紀60年代我國引進該疫苗株。該菌株是光滑型，可以持續刺激機體產生細胞免疫，提供保護力，但無法區分疫苗免疫和自然感染。

    Rev.1（B.melitensis REV.1）疫苗是Elberg等1957年從B.melitensis 強毒株6056血清中分離培養得到的，具有鏈霉素抗性。該菌株在適當條件下毒力可以完全恢復。較之S19有更高的流產率，同時意味著其有更完整的抗體特征刺激機體免疫系統，從而獲得更好的保護力。

    M5疫苗是1962年哈爾濱獸醫研究所通過對B.melitensis強毒株M28連續雞減毒獲得。該菌株有S型變異為R型的不穩定性，目前仍用于山羊的免疫，免疫后可保護1年時間。

    H38疫苗是1964年Renoux等將馬耳他布魯菌53H38號強毒菌株的培養液，經福爾馬林滅活后加入佐劑制成。屬于S型，在山羊和綿羊應用效果較好，安全性高，但存在局部化膿現象。

    S2（B.suis strain 2）疫苗是1952年我國獸醫藥品監察所從豬流產胚胎中分離得到的。該疫苗株與S19和Rev.1相比毒力較弱，在牛、羊、豬等畜種都能產生良好的免疫效果。丁家波等通過試驗動物比較S2、M5和A19 3種疫苗株的安全性和免疫保護效果，得出S2除了具有良好的免疫保護力外，還具有更優良的安全性。

    3.1.2 常見的粗糙型疫苗

    RB51疫苗是S型牛種2308菌株經利福平和青霉素的反復傳代獲得的突變株，特點是在2308株編碼糖基轉移酶蛋白的wboA基因中插入一段IS711序列。它在美國和南美地區被廣泛使用，但該疫苗的使用需嚴格控制劑量和免疫途徑，否則會導致嚴重感染和母畜流產。

    45/20疫苗是1922年從患布病牛的體內分離后又在豚鼠20次傳代培養得到的R型減毒滅活疫苗。免疫保護力較好，但存在R型與S型變異的不穩定性，逐漸被淘汰。

    3.2 基因工程疫苗

    利用基因工程（蛋白質工程）技術對現有的優質疫苗株進行改造培養出的工程菌株、重組質粒或代謝產物（蛋白質）等稱為基因工程疫苗。如美學者利用RB51菌株構建了超量表達Cu/Zn超氧化物歧化酶的重組株，優化原菌株的免疫保護力。此外，針對某基因區插入、替換或剔除特定序列從而構建突變株也屬于此類。

    3.2.1 DNA疫苗

    常見的DNA疫苗有p39（T淋巴細胞抗原）、L7/L12（核蛋白）、Omp31（外模蛋白）、Omp25（外模蛋白）、GroEL（熱休克蛋白）等。制備的原理是把含有目標抗原基因的重組質粒直接注射或感染動物細胞，誘導機體產生全面、持久的免疫應答。DNA疫苗誘導產生的細胞免疫反應較蛋白質疫苗要強烈，有良好的研究前景。

    3.2.2 蛋白質疫苗

    利用含有目標蛋白的基因序列在真核或原核細胞中表達產物（蛋白或多肽）制成的蛋白質疫苗，又稱亞單位疫苗。篩選最佳抗原是重組蛋白質疫苗的研究關鍵，后期常與其他佐劑相聯合使用，使機體產生更強烈的免疫應答。蛋白質疫苗的主要缺點是自身在機體內無法復制，且生產工藝復雜、成本高，故尚未普及。

    3.2.3 標記疫苗

    為區分疫苗免疫和自然染病，利用基因置換、刪除或缺失技術構建的工程菌，稱為標記疫苗。如將抗卡那霉素基因置換Rev.1菌株的p39基因（產物為胞質結合蛋白），獲得Rev.1-Δp39 疫苗株；剔除Rev.1 bp26序列的CGV26或者CGV2631獲得的疫苗株等。我國學者對M5-90菌株進行同源重組構建的基因缺失株也屬于標記疫苗類。

    較之傳統的疫苗，基因工程疫苗既保留了原有免疫活性，又解決了殘余毒力強的安全性問題，并可區分疫苗免疫和自然染病。布魯氏菌侵入機體產生的免疫應答及其逃避巨噬細胞的系統研究成為基因工程疫苗的發展鉗制因素。

    4 小結

    隨著我國畜牧業的集約化發展，布病的防治工作不容忽視。借鑒國外的防控和凈化經驗，當前疫苗的預防作用意義重大。如何研制出安全性、穩定性及免疫效果各方面都均衡的疫苗是未來的發展方向。通過政府管理部門及科研工作者等各方的努力，我國布病一定會得到有效控制。

   （葛瑞華 龔小林 潘乳玲  江西省南昌縣動物疫病預防控制中心）